《300：一个帝国的崛起》根据弗兰克·米勒（Frank Miller）漫画改编，故事从“温泉关战役”的十年之前开始。当时波斯国王大流士（Darius）率领的军队在马拉松战役（Battle of Marathon）中大败而归，他告诫儿子“薛西斯”（《三百斯巴达勇士》中的反派），不要进攻希腊，因为那会遭到天谴。但薛西斯没有理会，即位后集结了一支庞大的军队攻打希腊，誓要踏平此地为报父仇。
终于有一天，人类向日渐增多的血族和狼族宣战，这两个族群遭到大肆围剿与屠杀，人类取得绝对的优势。塞琳娜（凯特·贝金赛尔 Kate Beckinsale 饰）和约翰也在这场浩劫中遭难，当她再次醒来时，却发现自己被名为抗原研究所的机构囚禁起来，编号实验品1号。她奋力突破了束缚，根据共视的能力在黑暗的都市中寻找实验品2号——约翰。途中她遭遇血族的同伴相助以及狼人的袭击，当她找到被狼人们追逐的实验品2号时却发现，眼前竟是一个从没见过面但有着极为恐怖力量的小女孩——伊薇（英迪娅·埃斯利 India Eisley 饰）
手段无情冷酷的正义使者惩罚者卡斯尔（布莱恩·布鲁姆 Brian Bloom 配音）在追查军火贩子该隐（Kyle Hebert 配音）时遇到了黑寡妇（詹妮弗·卡朋特 Jennifer Carpenter 配音）和神盾局指挥官弗瑞（John Eric Bentley 配音）。神盾局志在防止他们所开发的尖端武器技术被利维坦等恐组织获取，因此急需沿着该隐这条线找到失窃的技术资料。崇尚个人主义的卡斯尔最终接受弗瑞的建议，和黑寡妇组成了临时搭档。然而卡斯尔绝不会轻易听从他人的安排，行动中他执意抓住作恶多端的该隐，为此
